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该试剂盒适用于活禽的新鲜类便、泄殖腔棉拭样品；病死或带菌禽的肝脏等组织及肠内容物的鸡白痢沙门氏菌特异性检测，用于鸡白痢沙门氏菌的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

• 样本的采集：
  无菌采集存活禽的新鲜类便、泄殖腔棉拭样品；病死或带菌禽的肝脏、胆囊、脾脏及其他病变组织盲肠扁桃体及肠内容物。
  
  • 粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
    
  • 拭子样品：反复涂抹采集部位，将拭子插入PBS缓冲液或生理盐水中碾磨数秒。
    
  • 病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
  • 上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
• DNA提取：
  可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购DNA提取试剂盒并按照相应试剂盒说明进行操作。
  
  • 培养物：取培养物50μL（培养至一定浊度）或者挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
    
  • 粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
    
  • 其他液体标本：取标本2～3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
  • 阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需提取），直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样本制备区域加入阳性对照。
• 试剂的准备：
  从试剂盒中取出鸡白痢沙门氏菌反应液（SP-qPCR MIX），完全复融并振荡混匀后，瞬时离心。
  设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），配制加样见下表，瞬时离心后尽快扩增检测。
  

  加入成分	加入量
  鸡白痢沙门氏菌反应液	15μL×N
  样本核酸/阳性对照/阴性对照	5μL×N
  总量	20μL×N

• qPCR反应条件：
  

  反应名称	循环数	反应参数
  产物消化	1循环	50℃ for 2min
  预变性	1循环	95℃ for 3min
  PCR扩增	40循环	95℃ for 15sec 60℃ for 30sec

  在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。
  • 使用ABI品牌仪器时，需将淬灭基团改为NONE，请勿选择ROX参比荧光。
• 试验成立判定：
  
  • 阴性对照（NTC）：不应产生任何的扩增曲线；
    
  • 阳性对照（SP-PTC）：均产生扩增曲线；
    
  • 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
• 结果判定：
  

  	Ct值≤35	无Ct值	35≤Ct值≤40且有明显扩增曲线
  FAM	阳性+	阴性-	可疑样本

  对于可疑样本，重新提取核酸，再次进行对应的PCR检测。如果重复结果Ct值≤40且出现对数扩增曲线判为样本阳性；否则判为样本阴性。

• 试剂盒应在?20℃以下保存和运输。
  
• 本试剂盒仅用于体外检测使用，操作人员必须经过培训，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。
  
• 不要使用过期组分或者不同批次组分混合使用。
  
• 使用时尽量避免反复冻融，冻融应不超过5次，否则建议分装后使用。
  
• 样本采集和处理过程应遵循生物安全管理要求。
  
• 荧光PCR实验严格分区操作，各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循单方向工作原则，各工作区相对隔离。
  
• 测试样本时，应做好生物安全防护。
  
• 试验完毕后，使用过的试剂盒、样本和试剂应进行无害化处理。